奧林巴斯倒置CKX53顯微鏡結合網(wǎng)格計數(shù)板是觀察和計數(shù)細菌的常用組合，其操作簡便、成像清晰，適用于微生物學、環(huán)境科學及工業(yè)發(fā)酵等領域的細菌定量分析。以下從設備準備、樣本處理、觀察計數(shù)及注意事項四個方面進行系統(tǒng)性說明：

一、設備與材料準備

顯微鏡配置

奧林巴斯CKX53倒置顯微鏡：

光源：優(yōu)先選用LED光源（如CKX-LED），提供穩(wěn)定均勻的照明，減少熱量對細菌活性的影響。

物鏡：根據(jù)細菌大小選擇10×、20×或40×物鏡（NA≥0.25），確保視野清晰且覆蓋網(wǎng)格區(qū)域。

目鏡：10×目鏡（視野直徑約1.8-2.0mm）適合常規(guī)計數(shù)，若需更高精度可換用15×或20×目鏡。

網(wǎng)格計數(shù)板：

類型：常用血細胞計數(shù)板（如Neubauer改進型）或專用細菌計數(shù)板（如Petroff-Hausser計數(shù)室）。

規(guī)格：

Neubauer計數(shù)板：中央?yún)^(qū)域分為25個中方格，每個中方格含16個小方格（邊長0.2mm，面積0.04mm2），深度0.1mm（體積0.004mm3=0.000004mL）。

細菌專用計數(shù)板：網(wǎng)格更細（如0.02mm2/小方格），適合高密度樣本。

輔助工具

蓋玻片（厚度0.17mm）、載玻片（可選）、移液器（10μL量程）、無菌吸頭、酒精棉球、記號筆。

二、樣本處理與制片

樣本稀釋

目的：將細菌濃度調整至20-200個/中方格（Neubauer計數(shù)板）或50-150個/小方格（細菌專用板），避免過度密集或稀疏。

方法：

初步估算濃度：取10μL樣本與990μL無菌水混合（1:100稀釋），重復稀釋至合適范圍。

制片步驟

清潔計數(shù)板：用酒精棉球擦拭計數(shù)板和蓋玻片，晾干后避免指紋污染。

蓋玻片放置：將蓋玻片輕壓在計數(shù)室上，確保無氣泡且邊緣密封（防止樣本溢出）。

加樣：用移液器吸取10μL稀釋后的樣本，從計數(shù)室邊緣緩慢注入，利用毛細作用使樣本均勻填充計數(shù)室。

靜置：等待2-3分鐘使細菌沉降，避免移動計數(shù)板導致分布不均。

三、顯微鏡觀察與計數(shù)

顯微鏡設置

對焦：切換至相差模式（若CKX53配備相差附件）或明場模式，調節(jié)粗/細準焦螺旋使網(wǎng)格線清晰可見。

光源調整：降低光源強度至適中（避免熒光干擾或細菌光損傷），關閉聚光鏡虹彩光圈以減少眩光。

視野選擇：優(yōu)先計數(shù)中央?yún)^(qū)域（如Neubauer計數(shù)板的4個角及中央共5個中方格），減少邊緣效應。

計數(shù)規(guī)則

邊界處理：對壓線細菌采用“數(shù)上不數(shù)下、數(shù)左不數(shù)右"原則（或統(tǒng)一計數(shù)上邊和左邊的細菌）。

死菌區(qū)分：若需區(qū)分活菌與死菌，可提前用臺盼藍染色（活菌拒染，死菌染藍），或通過形態(tài)差異（如破碎細胞）判斷。

重復計數(shù)：對同一樣本重復計數(shù)2-3次，取平均值以提高準確性。

四、注意事項與優(yōu)化技巧

避免誤差來源

樣本均勻性：稀釋后充分混勻，避免細菌沉降導致濃度不均。

網(wǎng)格對齊：確保計數(shù)板網(wǎng)格與顯微鏡視野十字線平行，減少計數(shù)偏差。

時間控制：計數(shù)應在樣本制備后30分鐘內完成，防止細菌繁殖或死亡影響結果。

特殊場景處理

高密度樣本：進一步稀釋至可計數(shù)范圍，或改用熒光染色結合自動計數(shù)軟件（如ImageJ的Cell Counter插件）。

運動性細菌：在樣本中加入少量甲醛（終濃度0.5%）固定細菌，或使用瓊脂覆蓋法限制運動。

鏈狀/簇狀細菌：記錄鏈或簇的數(shù)量，按單個細菌計算（或根據(jù)研究需求調整規(guī)則）。

設備維護

清潔：使用后用壓縮空氣吹除計數(shù)板殘留樣本，避免腐蝕金屬部件。

校準：定期檢查顯微鏡光源強度、物鏡分辨率及網(wǎng)格計數(shù)板精度（如通過標準微球驗證）。

五、應用案例

發(fā)酵工業(yè)：監(jiān)測乳酸菌發(fā)酵過程中的活菌數(shù)變化，優(yōu)化發(fā)酵條件（如pH、溫度）。

環(huán)境監(jiān)測：計數(shù)水體中的大腸桿菌群落，評估水質污染程度。

臨床診斷：快速檢測尿液或血液中的病原菌濃度，指導抗生素用藥劑量。

通過規(guī)范操作和細節(jié)優(yōu)化，奧林巴斯CKX53顯微鏡結合網(wǎng)格計數(shù)板可實現(xiàn)細菌濃度的快速、準確測定，為微生物研究提供可靠數(shù)據(jù)支持。